İzotop ayrılması, fiziksel ya da kimyasal bir süreç sırasında bir izotopun bir başka izotopa göre zenginleşmesi (miktarının oransal olarak artması). Her elementin izotopları farklı ağırlıklardadır, ama bunların, elektron sayılan tarafından belirlenen genel kimyasal özellikleri aynıdır. Ne var ki, izotopların kütlelerindeki farklılıkların kimyasal özelliklerde küçük farklılıklara yol açtığı kuramsal olarak belirlenebilir ve deneyselolarak da kanıtlanabilir. Orneğin, bir elementin izotoplarının belirli bir kimyasal tepkimedeki denge sabitleri biraz farklı olabilir; bundan ötürü de, böyle bir tepkime sonucunda izotop ayrılması gerçekleşir. İzotop ayrılmasının ölçüsü, ayrılma katsayısıyla (zenginleşme katsayısı) ifade edilir. Alfa (a) ile gösterilen bu katsayı, bir bileşik ya da faz içerisindeki izotopların birbirine oranının, sonuçta ortaya çıkan bileşik ya da fazdaki izetopların oranına bölünmesiyle elde edilir. Örneğin, Nh ve Na sırasıyla bir bileşikteki hafif ve ağır izotopların, nh ve na da öteki bileşikte bunlara karşılık gelen izotopların bolluğu ise, ayrılma katsayısı, a = (Nh/Na)/ (nh/na) olarak gösterilir. Ayrılma katsayısı, kimyasal bir tepkime ya da fiziksel bir süreç sonucunda iki izotopun bolluk oranlarında ortaya çıkan değişimi gösterir.
Dengede ayrılma sürecine kalsiyum karbonatın suda çökelmesi örnek verilebilir. Çökelme sırasında oksijen -18 yüzde 2,5 dolayında zenginleşir, Ayrılma katsayısı sıcaklığa bağlıdır; bu nedenle, çökelmenin oluştuğu suyun sıcaklığını belirlemede bu katsayıdan yararlanılabilir. Oksijen izotopları aracılığıyla jeolojik sıcaklık belirleme tekniği bu özellikten yararlanılarak geliştirilmiştir.
Fotosentez sırasında, karbonun hafif karbon izotopu olan karbon -12, ağır izotopu olan karbon-13’e oranla zenginleşir. Fotosentez sonucunda ağaçlardaki selüloz ve odunözünde (lignin) yüzde 2,5 dolayında zenginleşme ortaya çıkar. Hafif karbon izotopu fotosentez sürecini daha hızlı tamamlar, bu nedenle oranı yükselir. Bu örnekte, ayrılma, bir denge süreci değil kinetik (tepkime hızına ilişkin) bir olaydır.
Buharlaşma, yoğunlaşma ve ısıl yayınım gibi fiziksel süreçlerde de önemli ölçüde ayrılma ortaya çıkabilir. Örneğin buharlaşan deniz suyunda oksijenin hafif izotopu olan oksijen-16 zenginleşir; öte yandan, yoğunlaşma sırasında da sudaki ağır izotop zenginleşir. Bu, atmosferdeki su buharının içerdiği hafif oksijen izotopu oranının daha da artmasına neden olur. Ekvatorda buharlaşıp kutuplarda yoğunlaştığı için sudaki hafif oksijen izotopu miktarı kutuplarda yüzde 5’e varan oranlarda fazlalık gösterir. Uranyumun bölünebilir (çekirdek bölünmesi tepkimesine girebilen) izotopu uranyum-235 ile daha bol bulunan bölünemez izotopu uranyum-238, birbirlerinden, gaz halindeki heksaflüorürlerinin gözenekli engelleri farklı hızlarda geçmeleri olgusundan yararlanılarak ayrılır.
